Пцр лаборатории требования

1.1 . Настоящие методические указания устанавливают требования к помещениям лабораторий и порядку проведения в них работ с патогенными биологическими агентами (ПБА) III — IV групп патогенности с использованием методов, основанных на полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1.2 . Методические указания регламентируют выполнение исследований методом ПЦР с применением оборудования и тест-систем, разрешенных к применению на территории Российской Федерации в установленном порядке.

1.3 . Методические указания определяют принципы организации работы лабораторий, использующих метод полимеразной цепной реакции, на этапах выполнения ПЦР-анализа.

2.1 . СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». Минздрав России, 1999.

2.2 . СП 1.2.1318-03 «Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I — IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами». Минздрав России, 2003.

2.3 . СП 1.2.036-95 «Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I — IV групп патогенности». Госкомсанэпиднадзор России, 1995.

2.4 . МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I — II групп патогенности». Минздрав России, 2003.

2.5 . МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I — IV групп патогенности при работе методом ПЦР». Минздрав России, 2001.

2.6 . «Методические указания по применению бактерицидных ламп для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях» № 11-16/03-06 от 28.02.95. Минздравмедпром России, 1995.

3.1 . Полимеразная цепная реакция представляет собой процесс многократного увеличения числа копий (амплификация) фрагмента ДНК-мишени (кДНК), катализируемый in vitro термостабильной ДНК-полимеразой, и позволяет обнаружить специфичный участок генома биологического агента.

3.2 . ПЦР обладает высокой чувствительностью, специфичностью, обеспечивает возможность работы практически с любым видом биологического материала и объектами окружающей среды, позволяет выполнять анализ в течение 4 — 8 ч. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1 ´ 10 2 — 1 ´ 10 4 м.к. (геномэквивалент/мл), специфичность — 85 — 100 %.

3.3 . По результатам анализа выдают предварительный ответ о наличии в пробе специфических участков (фрагментов) ДНК или РНК, имеющих гомологию с определенным участком генома возбудителя того или иного инфекционного заболевания, а также о наличии в исследуемом материале генетических маркеров или генетически модифицированных ДНК.

3.4 . Проведение исследований методом ПЦР сопряжено с необходимостью обеспечения соблюдения правил биологической безопасности, а также определенных требований к организации и проведению анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами и получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов.

4.1 . Общие требования

4.1.1 . Работу с ПБА III — IV групп патогенности методом ПЦР проводят только при наличии в организации лицензии на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний человека, и санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения соответствующих работ в лаборатории, выданных в установленном порядке.

4.1.2 . Организацию работ на этапах приема, разбора и первичной обработки материала, подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот, а также обеззараживания проб проводят в соответствии с требованиями СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». Работу на остальных этапах ПЦР-анализа проводят, как с обеззараженным материалом.

4.1.3 . В лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА III группы патогенности, допускается проведение исследований методом ПЦР (без предварительного накопления возбудителя) с целью диагностики бруцеллеза, парентеральных вирусных гепатитов, ВИЧ-инфекции, возбудители которых относятся ко II группе патогенности.

4.2 . Требования к помещениям ПЦР-лаборатории

4.2.1 . Помещения ПЦР-лаборатории, проводящей работы с ПБА III — IV групп патогенности, должны соответствовать требованиям СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

4.2.2 . Проведение исследований методом ПЦР с ПБА III — IV группы патогенности допускается на базе действующих микробиологических (бактериологических, вирусологических, иммунологических и др.) лабораторий при условии соблюдения требований СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами» и организации в лаборатории самостоятельных или выделенных в составе других функциональных помещений рабочих зон, соответствующих этапам ПЦР-анализа.

4.2.3 . ПЦР-лаборатория должна включать следующий минимальный набор рабочих зон:

• приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала;

• приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР;

• детекции продуктов амплификации методом электрофореза или ГиФА.

4.2.4 . В ПЦР-лабораториях необходимо также предусмотреть наличие вспомогательных помещений: комнаты ведения учетных документов или ординаторской (комнаты персонала) * ; кабинета заведующего лабораторией * ; раздевалки для сотрудников ** ; комнаты приема пищи ** ; туалета ** ; подсобных (складских) помещений ** .

* Помещения могут быть объединены.

** Помещения могут быть общими с другими подразделениями учреждения.

4.2.5 . Необходимо наличие автоклавной комнаты для обеззараживания исследуемого материала. Она может быть общей с другими подразделениями учреждения при условии соблюдения требований биологической безопасности.

4.2.6 . Помещения для выполнения работ на этапах ПЦР-анализа должны быть боксированными (боксы с предбоксами).

4.2.7 . В зоне приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала проводят прием ПБА, пробоподготовку (сортировку, маркировку, центрифугирование и др.), хранение и первичную инактивацию остатков биоматериала дезинфицирующими средствами. Зону приема, регистрации, разбора и первичной обработки материала располагают в комнате приема материала или в отдельном боксированном помещении. Здесь же можно проводить прием и обработку проб для исследования другими методами (бактериологическими, вирусологическими, иммунологическими и т.д.), при условии выделения отдельного оборудованного рабочего места для ПЦР-анализа.

4.2.8 . Зону выделения нуклеиновых кислот размещают в отдельном помещении. При организации ПЦР-лаборатории на базе действующей микробиологической лаборатории допускается выделение НК в помещениях, в которых проводят другие виды исследований, кроме генно-инженерных работ и работ по накоплению ПБА. В этом случае в помещении организуют рабочую зону для выделения нуклеиновых кислот (НК), в которой располагают ПЦР-бокс или бокс биологической безопасности. В ПЦР-боксе (или боксе биологической безопасности) для выделения НК не допускается проведение других работ.

4.2.9 . В зоне приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР производят приготовление ПЦР-смеси, внесение в пробирку для ПЦР выделенных препаратов ДНК или кДНК, обратную транскрипцию РНК и амплификацию ДНК или кДНК. Помещение для приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР должно быть отдельным. Приготовление реакционных ПЦР-смесей проводят в ПЦР-боксе.

4.2.10 . При необходимости этап выделения НК может быть совмещен в одном помещении с этапом приготовления реакционных смесей и проведения ПЦР при наличии в нем отдельных ПЦР-боксов (боксов биологической безопасности) — для подготовки реакционных ПЦР-смесей и для выделения НК.

4.2.11 . Зону детекции продуктов амплификации располагают в отдельном помещении, по возможности оснащенном ПЦР-боксом.

4.2.12 . При необходимости одновременного использования для детекции продуктов амплификации метода электрофореза и метода гибридизационного анализа следует выделить в помещении детекции отдельную рабочую зону для проведения гибридизационного анализа. В этом случае оборудование и принадлежности для каждого вида детекции маркируют применительно к каждой зоне. Не допускается использовать для проведения гибридизационного анализа пипетки и посуду, предназначенные для электрофореза.

4.2.13 . Планировочные решения и размещение оборудования должны обеспечивать поточность движения исследуемого материала. Следует полностью исключить воздухообмен между помещением детекции продуктов амплификации и другими помещениями.

4.2.14 . Лабораторию оборудуют водопроводом, канализацией, электричеством и отоплением в соответствии с СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами». Все помещения лаборатории обеспечивают достаточным естественным и искусственным освещением.

4.2.15 . При строительстве новых или реконструкции имеющихся ПЦР-лабораторий помещения оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией. Разница в давлении воздуха в помещениях ПЦР-лаборатории достигается за счет различий в кратности воздухообмена в них. Кратность воздухообмена должна соответствовать значениям, приведенным в таблице.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРОВЕДЕНИЮ РАБОТ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОД ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ.

1. Область применения

Данный документ предназначен для учреждений здравоохранения и санэпиднадзора, использующих метод полимеразной цепной реакции в целях диагностики инфекционных заболеваний.

2. Обоснование необходимости

Благодаря высокой специфичности и чувствительности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) находит широкое применение в диагностике возбудителей инфекционных заболеваний. Однако ПЦР-диагностика инфекций связана с проблемой, обусловленной высокой чувствительностью метода, — возможностью контаминации.

Попадание в реакционную пробирку следовых количеств положительной ДНК (специфических продуктов амплификации ДНК — ампликонов; ДНК-стандарта, используемой в качестве положительного контроля; положительной ДНК клинического образца) приводит к амплификации в процессе ПЦР специфического фрагмента ДНК и, как следствие, к появлению ложно-положительных результатов.

Сотрудник, занимающийся ПЦР-диагностикой, в своей работе сталкивается с двумя видами контаминации:

1. перекрестная контаминация от пробы к пробе (в процессе обработки клинических образцов или при раскапывании реакционной смеси), приводящая к появлению спорадических ложно-положительных результатов;

2. контаминация продуктами амплификации (ампликонами), имеющая наибольшее значение, поскольку в процессе ПЦР ампликоны накапливаются в огромных количествах и являются идеальными продуктами для реамплификации.

Контаминация следовыми количествами ампликонов посуды, автоматических пипеток и лабораторного оборудования, поверхностей лабораторных столов или даже поверхности кожи сотрудников лаборатории приводит к появлению систематических ложно-положительных результатов.

Как правило, определить источник контаминации бывает очень трудно и требует значительных затрат времени и средств.

Накопленный к настоящему времени опыт работы лабораторий, использующих полимеразную цепную реакцию для диагностики инфекций (ПЦР-диагностические лаборатории) позволяет сформулировать основные требования к планировке таких подразделений и проведению самих анализов. Соблюдение данных требований обеспечивает исключение возможности контаминации и получения ложно-положительных результатов.

3. Планировка помещений и основные принципы организации работы ПЦР-диагностических лабораторий

1). Лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты) для каждой из стадий ПЦР-диагностики. Следует иметь не менее двух комнат:

— пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты и т.д.), ПЦР-диагностика которых проводится в данной лаборатории.

— пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации; в пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекций, диагностика которых проводится в данной лаборатории.

2). Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует расположить как можно дальше от пре-ПЦР-помещений.

3). Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате приготовления реакционной смеси и в комнате обработки клинических образцов должны быть установлены настольные боксы с ультрафиолетовыми лампами.

5). Работа в лаборатории должна быть организована в одном направлении: от пре-ПЦР-помещений к пост-ПЦР-помещению.

6). Каждое помещение ПЦР-диагностической лаборатории должно иметь свой набор реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, лабораторного оборудования, халатов и перчаток, используемых только в данном помещении и не выносящихся в другие ПЦР-помещения. Оборудование, материалы и инвентарь в каждой комнате должны иметь соответствующую маркировку.

7). Обработка рабочей одежды из пре- и пост-ПЦР-помещений должна производиться раздельно.

8). Следует однократно использовать перчатки, как в комнате обработки клинических образцов, так и в комнате приготовления реакционной смеси и постановки ПЦР.

9). Необходимо однократно использовать пробирки и наконечники для автоматических пипеток. Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой с целью предотвращения перекрестной контаминации в процессе выделения ДНК или при раскапывании реакционной смеси.

10). Необходимо использовать наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером (или наконечники с ватными фильтрами, приготовленными в помещении, в котором не ведутся работы с ДНК) при обработке клинических образцов, а также при внесении выделенной ДНК в реакционную пробирку.

11). Каждый сотрудник лаборатории должен иметь персональный набор автоматических пипеток и реагентов.

12). В пре-ПЦР и пост-ПЦР-помещениях лаборатории должны работать разные сотрудники.

13). Клинические образцы должны храниться отдельно от реагентов.

14). Не следует использовать водяные бани, т.к. заполняющая их вода, просачиваясь в недостаточно плотно закрытые пробирки, может стать источником контаминации; следует использовать суховоздушные термостаты.

15). При исследовании материала зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний I-IV групп работа должна проводиться с соблюдением “Санитарных правил СП 1.2.011-94 (Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности)” и “Положения о порядке учета, хранения, обращения, отпуска и пересылки культур бактерий, вирусов, рикетсий, грибов, простейших, микоплазм, бактерийных токсинов, ядов биологического происхождения”, М., 1980.

16). Необходимо постоянно поддерживать чистоту на рабочем месте:

— каждое помещение должно иметь свой отдельный набор инвентаря для обработки и уборки рабочего места (ватно-марлевые тампоны, пинцет, 70о этанол, дезинфицирующий раствор и т.д.), и источники ультрафиолетового излучения, которые эффективно инактивируют ДНК-матрицы.

— при манипуляциях с клиническим материалом рабочую поверхность до и после исследования обрабатывают дезинфицирующим раствором (указанным для данного возбудителя) и затем 70о этанолом.

— следует обрабатывать рабочую поверхность в комнате приготовления реакционной смеси до работы 70о этанолом с целью борьбы с пылью.

17). Следует полностью исключить проведение в ПЦР-диагностической лаборатории работ, связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности ДНК или фрагментов генов возбудителей, которые диагностируются в данной лаборатории.

18). Персонал, работающий в ПЦР-диагностической лаборатории должен пройти соответствующее обучение.

4. Требования к проведению ПЦР-анализа

4.1. Обработка клинических образцов.

1). Забор клинических образцов необходимо производить только в одноразовые пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, предварительно обработанные в течение 1 часа хромовой смесью, тщательно промытые дистиллированной водой и прокаленные.

2). Работать только в одноразовых перчатках.

3) необходимо использовать одноразовые наконечники для автоматических пипеток с аэрозольным барьером.

4). Обязательно менять наконечники при переходе от одной пробы к другой.

5). Использованные пробирки и наконечники должны сбрасываться в одноразовые контейнеры или в специальную емкость с 1Н раствором соляной кислоты.

4.2. Постановка ПЦР.

1). Работать только в одноразовых перчатках.

2). Следует готовить смесь реактивов для ПЦР, рассчитанную на все пробы, включая контрольные, и затем — раскапывать ее по пробиркам.

3). Использовать автоматические пипетки с переменным объемом и одноразовые наконечники.

4). В каждый момент работать только с одной пробиркой.

5). Во всех случаях постановки ПЦР следует обязательно применять отрицательные и положительные контроли в соответствии с инструкцией по применению диагностических наборов.

6). Подготовленные к ПЦР исследуемые образцы должны добавляться в реакционные смеси одноразовыми наконечниками с аэрозольным барьером в последнюю очередь. Использованные наконечники следует сбрасывать в емкость с 1Н. раствором HCl.

4.3. Детекция продуктов амплификации.

1). Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью.

2). Работать следует только в одноразовых перчатках.

3). Оборудование, реактивы, халаты, перчатки, а также уборочный инвентарь, используемые в комнате детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение), должны храниться только в этой комнате и не должны попадать в пре-ПЦР-помещения.

4). В комнате детекции продуктов амплификации необходимо работать в сменной обуви.

5. Использование физических и химических методов борьбы с контаминацией

1). Рабочие поверхности, оборудование и материалы следует облучать ультрафиолетом с максимумом излучения в области 260 нм. Облучение необходимо проводить в течение 1 часа до начала работы и в течение 1 часа после окончания работы.

2). Использованные наконечники для автоматических пипеток, пробирки и другие загрязненные ДНК материалы необходимо обрабатывать реагентами, вызывающими деградацию ДНК (1 Н HCl, 10% гипохлоритом натрия или 10% хлорной известью).

6. Оценка качества работы ПЦР-диагностической лаборатории

1). Для оценки качества работы ПЦР-диагностической лаборатории следует периодически применять зашифрованные внутрилабораторные контрольные положительные и отрицательные образцы, охарактеризованные не только с помощью полимеразной цепной реакции, но и другими методами диагностики данной инфекции.

2). Следует периодически проводить оценку чувствительности диагностических наборов на основе полимеразной цепной реакции.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Москва, 1995 г.

Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора; исполнители: Покровский В.В.,Федоров Н.А.,Шипулин Г.А.,Безруков В.М.

Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Госкомсанэпиднадзора; исполнители: Бектимиров Т.А.,Блоха В.В.

Российским научно-исследовательским противочумным институтом Госкомсанэпиднадзора; исполнитель: Куличенко А.Н.

2. УТВЕРЖДЕНО “22” июня 1995г.

Рассмотрены и рекомендованы к утверждению Ученым советом ГИСК им. Л.А.Тарасевича (протокол № 5 от 28 марта 1995 года)

Оставьте комментарий